欢迎您访问宣城市科学技术协会网站!

CREB1在胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响

信息来源:本站    更新时间:2019-11-09    点击次数:23861次

钱进1*,徐英纳1,陶振玉1史岩2,栾文康3,颜伟3

1宣城市人民医院神经外科,安徽宣城 2420002南京医科大学附属南京第一医院神经外科,江苏南京 2100063南京医科大学第一附属医院神经外科,江苏南京 210029

[摘要]目的:探讨CREB1在胶质瘤中的表达其对人脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响。方法:分析中国脑胶质瘤基因组计划(CGGA)数据库中CREB1在不同级别的胶质瘤组织中的表达数据。运用CGGA数据分析CREB1的表达水平与胶质细胞瘤病人临床预后的相关性。采用CREB1小干扰RNAsi-CREB1)转染胶质瘤U251U87细胞,通过CCK8试验及transwell试验观察下调CREB1表达后胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的变化。结果:CREB1在人脑高级别胶质瘤组织中的表达高于低级别组,胶质瘤病人中高表达CREB1提示预后不良。下调CREB1表达可以抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力。结论:CREB1与胶质瘤的病理级别和临床预后相关,si-CREB1可以抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力。

[关键词]胶质瘤;临床预后;CREB1;增殖;侵袭

[基金项目]国家青年自然科学基金项目(81502168

*通信作者 (Corresponding author)E-mailqj791109@163.com

Expression of CREB1 in glioma and its effect on the proliferation and invasion of glioma cells

Qian Jin1*Xu Yingna1Tao Zhenyu1Shi Yan2Luan Wenkang3Yan Wei3

1Department of NeurosurgeryXuancheng People's HospitalXuancheng 2420002Department of NeurosurgeryNanjing First HospitalNanjin Medical UniversityNanjing 2100063Department of Neurosurgerythe First Affiliate Hospital of Nanjin Medical UniversityNanjing 210029China

Abstract ObjectiveTo study the expression of CREB1 in glioma and its effect on the proliferation and invasion of human glioma cells. MethodsThe expression of CREB1 in different grade glioma tissues were analyzed within the Chinese Glioma Genome Atlas expression Dataset(CGGA).The correlation between the expression of CREB1 and the clinical suvival in glioma patients was analyzed by using CGGA Dataset. The small interfering RNA of CREB1(si-CREB1) were transfected into U251 and U87 glioma cells,the effect of down-regulation of CREB1 on cell proliferation and invasion were tested by CCK8 assay and transwell assay. ResultsThe expression of CREB1 in higher grade glioma tissues exceeded that in lower grade group. High-expression of CREB1 associated with poor survival in glioma patients. Down-regulation of CREB1 suppressed the ability of proliferation and invasion in glioma cells. ConclusionThe expression level of CREB1 relates with tumor pathological grade and clinlical prognosis in glioma. si-CREB1 inhibits proliferation and invasion in glioma cells.

KeywordsGliomaClinical survivalCREB1ProliferationInvasion

胶质瘤是中枢神经系统中最常见的一种原发性肿瘤,病理恶性特点主要表现为肿瘤组织过度增殖并向周围脑组织侵袭,呈浸润性生长,目前认为其发病机制是多基因异常调控所致。环磷酸腺苷应答元件结合蛋白(cAMP-responsive element binding protein1CREB1)是真核细胞转录因子,分子量为43kDa,属于ATF/CREB家族,主要通过cAMP依赖的细胞信号转导途径调控基因的表达,其转录活性的激活由自身的磷酸化所决定,在生命过程中发挥重要作用[1]。对于CREB1基因的研究一方面集中于神经系统高级生理活动过程中,如抑郁症[2]、帕金森病[3]、神经元缺氧损伤修复[4]等。另一方面,CREB1在人体恶性肿瘤中作为一种重要的原癌基因的相关研究愈发受到重视,已有证据表明CREB1在人类肺癌[5]、乳腺癌[6]、白血病[7]等多种肿瘤组织中高表达。本研究检测分析CREB1在脑胶质瘤中的表达情况及与临床预后的关系,并探讨其对胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响。

1.材料与方法

1.1 材料:

人胶质瘤细胞系U87U251细胞均购自中科院上海细胞库。Opti-MEMIDMEM 培养基和新生胎牛血清均购自于美国GIBCO公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。CREB1小干扰RNA购自上海吉玛公司,序列:5-GUC UCC ACA AGU CCA AAC ATT-3′,5-GGC CUG CAA ACA UUA ACC ATT-3′。CCK8试剂盒购自中国碧云天公司。Matrigel基质胶购自美国BD Biosciences公司。CREB1 (1:400)抗体购自美国SantaCruz公司,GAPDH (1:5000)抗体购自美国Bioworld公司,二抗(1:2000)购于美国Santa Cruz公司。Pierce ECL发光液购自Pierce公司。

CREB1基因芯片表达谱数据和临床随访数均下载自中国脑胶质瘤基因组计划(Chinese Glioma Genome Atlas CGGA)官方网站http://www.cgga.org.cn/portal.php325例不同级别胶质瘤样本表达数据 (其中低级别WHO II109高级别WHO III72+ WHO IV144),应用单因素方差分析进行数据分析;310例胶质瘤临床预后数据,其中CREB1高表达组102例,低表达组208例,应用Kaplan-Meier log-rank检验进行数据分析。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组和细胞转染

U87U251细胞培养于10%新生牛血清的DMEM培养基,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,取对数生长期细胞实验。将实验分为二组:阴性对照组(转染无义序列NC)和si-CREB1转染处理组(si-CREB1)。按照Lipofectamine 2000说明书将si-CREB1Lipofectamine 2000混合于Opti-MEMI中,得到转染混合液,静置20分钟后将转染混合液加入细胞中,放入37℃、5%CO2培养箱中,8h之后更换为完全培养基。

1.2.2 western blot

转染96小时后,NC组、si-CREB1组各l×106U87U251细胞用RIPA裂解液裂解,收获蛋白并行BCAbicinchonininc acid, 二辛可酸)法定量,30μg蛋白上样于12SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,湿转至PVDF膜并用5%脱脂奶粉于37℃条件下封闭1小时,一抗(CREB1 1:400稀释) 4℃孵育过夜,HRP标记的二抗孵育90分钟,以GAPDH作为内参,将超敏发光液加在PVDF膜上,曝光显影,验证转染si-CREB1的转染效果。

1.2.3 细胞增殖实验

各组 U87U251细胞消化后重悬于培养液中,每孔1×104个细胞接种于96孔培养板中,按转染试剂lipo2000说明书进行细胞转染。各组转染后细胞溶液于转染后24h48h72h96h检测。检测前4小时每孔加入5μlCCK8溶液,到达检测点时弃去培养液,用酶标仪测定各孔的吸光度值,波长为450nm,取平均值。

1.2.4 细胞侵袭实验

应用24孔预铺MatrigelTranswell膜行细胞体外侵袭实验。将各组细胞种植于Transwell小室内,每孔上室含3×104个细胞和无血清DMEM培养基200μl,下室为含20%胎牛血清的DMEM培养基500μl。培养48小时后,将上室未侵袭细胞用湿棉签擦去,以95%酒精固定,以0.1%结晶紫染色,拍照(×200),计数。

1.3 统计学方法

生存随访数据运用Kaplan-Meier 生存分析和log-rank检验进行分析,其它数据运用单因素方差分析,各组实验均独立重复3次,实验数据均以均数±标准差表示,应用SPSS 11.5软件进行统计学分析,用P0.05*P0.01**)表示差异有统计学意义。

2.结果

2.1 CREB1在高级别人脑胶质瘤组织中表达高于低级别胶质瘤,胶质瘤病人中高表达的CREB1提示预后不良

CREB1325 例不同级别胶质瘤中的表达数据(CGGA)分析显示:高级别胶质瘤(WHOIII-IV级)组织中CREB1的表达水平明显高于低级别胶质瘤(WHO II级)组织(图1A)(P0.01)。CGGA310例胶质瘤病人临床随访数据分析显示:CREB1高表达组胶质瘤病人预后较低表达病人差,log-rank检验P=0.003提示在胶质瘤中CREB1高表达作可为一个独立的预后不良因素(图1B)(P0.01)。

2.2 si-CREB1可抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力

由于CREB1在胶质瘤中高表达,文献亦报道其作为原癌基因在多种肿瘤中有重要调控作用,我们运用CREB1小干扰RNAsi-CREB1)敲低CREB1的表达来观测其癌基因作用是否得到抑制。Western blot验证转染si-CREB1U251U87两组细胞的CREB1表达降低(图2A)。CCK8细胞增殖实验结果表明U87细胞在转染si-CREB1后,其平均吸光度24小时为0.48±0.0248小时为1.00±0.1172小时为1.46±0.1996小时为2.17±0.23,而对照组平均吸光度24小时为0.49±0.0148小时为1.27±0.0972小时为2.48±0.1896小时为3.64±0.20,和对照组相比,实验组在72h96h处细胞增殖显著下降,且有统计学意义(P<0.01)。在U251细胞中,处理组吸光度24小时为0.47±0.0448小时为0.80±0.0272小时为1.41±0.1796小时为1.92±0.27,对照组24小时为0.46±0.0148小时为1.03±0.1372小时为2.09±0.1696小时为3.15±0.24,产生的抑癌效果与U87细胞相似,在72h96h处实验组细胞增殖较对照组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)(图2B)。体外Transwell实验检测其对胶质瘤细胞侵袭能力的影响,结果发现si-CREB1转染组U87细胞穿过人工基底膜数为(28.3±4.5)个,而阴性对照组分别为(57.6±5.0)个,差异具有统计学意义(P<0.01)U251细胞转染si-CREB1后,转染组及对照组穿过的细胞数分别为(22.0±2.6)个和(46.0±4.4)个,差异具有统计学意义(P<0.01) (图2C)。该结果显示敲低CREB1表达能够有效抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力。

3.讨论

CREB1基因组位于人类染色体2q34,是转录因子中的激活转录因子(ATF)/CREB家族中的一员,是调节转录的核蛋白因子,主要通过cAMP依赖的细胞信号转导途径调节基因的表达。在静息期细胞中,CREB1以去磷酸酸化状态存在,无转录活性,当细胞内cAMPCa2+水平升高时,CREB1133位丝氨酸被蛋白激酶A磷酸化后被激活,活化的CREB1识别保守的cAMP反应元件,从而调节其下游靶基因的表达[8]CREB1调控的靶基因涵盖了从神经传导、生长因子和激素、细胞结构、细胞生存、离子通道、细胞代谢、信号通路到基因转录调节等诸多方面,在众多的细胞生理活动中发挥重要的作用[9-10]。目前CREB1与肿瘤发生发展的关系日益受到重视,成为近年来研究热点。Dimitrova[11]运用全新的生物基因信息网络分析软件inflo去寻找有效的生物基因标记物和靶点时发现cAMP-CREB1线轴通路在卵巢癌中发挥着重要的分子调控作用。Chhabra[12]研究发现CREB1在乳腺癌中高表达,恶性较高的浸润性导管癌中表达显著升高,乳腺癌患者生存期亦和CREB1的表达相关,高表达的CREB1与预后负相关。Li[13]研究发现CREB1在肾癌组织和细胞系中高表达,下调CREB1表达可以影响细胞的增值、迁徙、凋亡等功能从而抑制肾癌肿瘤发生,在肾癌中CREB1还可以被miR-10b-5pmiR-363-3p靶向调控影响肿瘤发生。

在胶质瘤的分子生物研究当中,CREB1多被报道为重要的转录因子参与miRNA的调控网络当中,并形成多条反馈环行通路[14]Peng[15]发现miR-200b可以靶向CREB1抑制胶质瘤的生长。Tan[16]发现在胶质瘤细胞中CREB1可以通过靶向miR-23a的表达进而调控PTEN来促进胶质瘤的生长,提出CREB1-miR-23a-PTEN的非编码RNA介导多基因路径在胶质瘤中的调控方式。Gregor[17]在研究分子磷酸化在胶质母细胞瘤组织的调控作用时,挑选了12条最重要的磷酸化通路,在60例组织标本中运用RPPA技术结合随访资料发现pCREB1/CREB1NOTCH-ICD/NOTCH1pGSK3β/GSK3β磷酸化在肿瘤病人中发挥重要作用并与预后生存相关。本研究首次运用CGGA大数据分析了CREB1在不同级别胶质瘤中的表达情况及与临床预后的关系,与CREB1在其他肿瘤中表达情况相似,在胶质瘤中亦作为癌基因高表达且与级别相关,高级别胶质瘤中的表达高于低级别胶质瘤。患者生存数据随访也证实CREB1的表达水平和患者生存期相关,高表达的CREB1提示预后不良。我们进一步探讨了CREB1在细胞水平如何影响胶质瘤的肿瘤恶性生物学功能,体外试验中用si-CREB1下调CERB1的表达,运用CCK8试验和transwell试验对胶质瘤的增殖及侵袭能力进行检测,结果发现si-CREB1转染后能明显抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力。

这些结果表明,CREB1与胶质瘤的级别和临床预后相关,具有一定的临床分子标记评估价值,CREB1对胶质瘤细胞的增殖和侵袭具有调控作用,在胶质瘤的恶性进展过程中具有重要的意义。下一步我们将着力于CREB1与其他重要信号通路和胶质瘤临床重要分子标志物的相关性研究,为胶质瘤疾病的发病机制和基因治疗策略提供更多的实验依据。

[参考文献]

[1] Montminy MR and Bilezikjian LM. Binding of a nuclear protein to the cyclic-AMP response element of the somatostatin gene[J]. Nature, 1987, 328(6126):175-178.

[2] Zhou W J, Xu N, Kong L, et alThe antidepressant roles of Wnt2 and Wnt3 in stress induced depressionlike behaviors[J]. Transl Psychiatry, 2016, 6(9):e892.  

[3] Huang Q, Du X, He X, et alJNK-mediated activation of ATF2 contributes to dopaminergic neurodegeneration in the MPTP mouse model of Parkinsons disease[J]. Exp Neurol, 2016, 277:296-304

[4] Lin W Y, Chang Y C, Lee H T, et al. CREB activation in the rapid intermediate and delayed ischemic preconditioning against hypoxic-ischemia in neonatal rat[J]. J Neurochem, 2009, 108(4):847-859

[5] Park SA, Lee JW, Herbst RS, et alGSK-3alpha is a novel target of CREB and CREB-GSK-3alpha signaling participates in cell viability in lung cancer[J]. PLOS ONE, 2016, 11(4):e0153075 

[6] Zhang J, Ma Y, Wang S, et al. C/EBP alpha inhibits proliferation of breast cancer cells via a novel pathway of miR-134/CREB[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(11):14472-14478

[7] Tregnago C, Manara E, Zampini M, et al. CREB engages C/EBPdelta to initiate leukemogenesis[J]. Leukemia, 2016, 30(9):1887-1896.  

[8] Haus-Seuffert P and Meisterernst M. Mechanisms of transcriptional activation of cAMP-responsive element-binding protein CREB[J]. Mol Cell Biochem , 2000, 212:5-9. 

[9] Montminy M, Brindle P, Arias J, et alRegulation of somatostatin gene transcription by cyclic adenosine monophosphate[J]. Metabolism , 1996, 45:4-7. 

[10] Lonze BE and Ginty DD. Function and regulation of CREB family transcription factors in the nervous system[J]. Neuron, 2002, 35(4):605-23. 

[11] Dimitrova N, Nagaraj AB, Razi A, et alInFlo: a novel systems biology framework identifies cAMP-CREB1 axis as a key modulator of platinum resistance in ovarian cancer[J]. Oncogene, 2017, 36(17):2472-2482.  

[12] Chhabra A, Fernando H, Watkins G, et al. Expression of transcription factor CREB1 in human breast cancer and its correlation with prognosis[J]. Oncol Rep, 2007, 18(4):953-958.

[13] Li Y, Chen D, Li Y, et alOncogenic cAMP responsive element binding protein 1 is overexpressed upon loss of tumor suppressive miR-10b-5p and miR-363-3p in renal cancer[J]. Oncol Rep. 2016, 35(4):1967-1978.  

[14] Ya-Wen Wang, Xu Chen, Rong Ma, et al. Understanding the CREB1-miRNA feedback loop in human malignancies[J]. Tumor Biol, 2016, 37:8487-8502. 

[15] Peng B, Hu S, Jun Q, et alMicroRNA-200b targets CREB1 and suppresses cell growth in human malignant glioma[J]. Mol Cell Biochem, 2013, 379:51-58. 

[16] Tan X, Wang S, Zhu L, et al. cAMP response element-binding protein promotes gliomagenesis by modulating the expression of oncogenic microRNA-23a[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109:15805-15810. 

[17] Hutter G, Sailer M, Azad TD, et alReverse phase protein arrays enable glioblastoma molecular subtyping[J]. J Neurooncol, 2017, 131(3):437-448.  

1  CREB1在不同级别胶质瘤组织中的表达及其与临床预后的关系

Figure 1  The expression of CREB1 in diffrent grade giloma tissues and its correlation to prognosis

A:单因素方差分析CREB1在不同级别胶质瘤中的表达数据,CREB1在高级别(WHOIII-IV级 216)胶质瘤组织中表达水平高于低级别(WHO II109)胶质瘤(P<0.01n=325)BKaplan-Meier生存分析胶质瘤临床预后数据,结果显示CREB1表达组预后较低表达组差 (P<0.01n=310)


2  si-CREB1对胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响

Figure 2  The effect of si-CREB1 on proliferation and invasion in glioma cells

A:转染si-CREB1后,在U251U87细胞中,western blot检测均提示CREB1的表达降低。BU87U251胶质瘤细胞转染si-CREB1后与对照组相比,其增殖能力被抑制P<0.015C:转染si-CREB1组较对照组相比,胶质瘤细胞侵袭能力明显抑制(显微镜下拍照×200),穿过人工基底膜细胞计数明显降低(P<0.01)


钱进:

男,1979-11,副主任医师,医学博士,宣城市人民医院神经外科副主任,安徽省医师协会胶质瘤专业委员会委员,安徽医药杂志审稿专家。

从事神经外科临床工作多年,擅长颅脑和脊柱肿瘤及三叉神经、面肌痉挛等颅神经疾病的临床诊治,擅长神经导航及内镜微侵袭技术应用。曾在北京三博脑科医院、江苏省人民医院、南京鼓楼医院、安徽省立医院交流学习。

从事脑胶质瘤的基础临床研究工作多年,参与多项国家级和省级科研项目,主持并参与市级和院级科研和三新技术项目多项并多次获奖,发表SCI和国内核心期刊论文10余篇,编著论著1部,发表论文多次获省级和市级优秀科技论文奖项。